科研
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清华新闻网3月27日电 昼夜节律广泛存在于地球上的生物体中，是生物体预知并响应环境的昼夜变化的重要机制。昼夜节律在维持生理稳态和人体健康中发挥着关键作用，其紊乱可能引发睡眠障碍、肥胖、免疫力下降等疾病，并增加癌症及精神疾病的风险，对人类健康构成严重威胁。
生物钟是昼夜节律的分子机制，以转录-翻译负反馈环路（transcription–translation feedback loop,TTFL）的形式发挥功能。TTFL模型是20世纪90年代提出的，目前在不同生物钟系统中得到了广泛应用。然而，随着研究的深入，TTFL理论面临诸多挑战。
3月26日，清华大学生物医学交叉研究院张二荃实验室在《自然》（Nature）发表题为“p环NTPase RUVBL2是真核生物中保守的时钟成分”（The P-loop NTPase RUVBL2 is a conserved clock component across eukaryotes）的研究论文。在已有研究基础上，进一步揭示了RUVBL2作为真核生物钟的共同核心成分，并支持了最初在蓝藻中发现的“缓慢ATP酶活性是生物钟共同特征”的观点。
在此前的研究中，张二荃实验室发现RUVBL2——一种低水解活性的AAA+ ATPase，在哺乳动物的生物钟复合物（mega-dalton super-complex）中发挥关键作用，并调控昼夜节律的相位与振幅。然而，由于周期通常被认为是衡量昼夜节律功能更可靠的参数，而此前的研究缺乏直接证据表明RUVBL2参与周期调控，因此RUVBL2是否为核心生物钟组分仍存在争议。为了弥补这一缺陷，该研究团队利用CRISPR/Cas9介导的高通量筛选技术，对近1000个RUVBL2敲入突变体进行全面分析。实验结果表明，在人类U2OS细胞中，多个RUVBL2突变体呈现短周期、长周期或无节律的不同表型。这种通过靶向单一基因即可同时调控振幅、相位，并引起双向周期变化的现象，仅在少数核心生物钟基因（例如果蝇的Per和蓝细菌的kaiC）中被观察到。此外，RUVBL2的表达具有节律性、可被环境因子调节，并且其敲除会导致无节律表型，进一步证明了RUVBL2是生物钟的核心成分（图1）。
图1.RUVBL2是生物钟的核心组成成分
（a）在细胞中敲入突变会导致长周期、短周期或无节律的表型，而在小鼠SCN过表达RUVBL2突变体可重现长周期和短周期的节律变化。此外，细胞与小鼠的周期表型呈线性相关；（b）在小鼠SCN中敲除Ruvbl2会导致其在恒定黑暗条件下丧失活动节律
为了探究RUVBL2如何影响生物钟周期，研究团队对突变位点进行了深入分析，发现这些突变主要集中在P-loop结构域——这一区域与ATP结合密切相关，提示RUVBL2可能通过ATP水解调控周期振荡。进一步实验显示，RUVBL2突变体的周期调节独立于TTFL复合物中的CRY，即便在CRY蛋白水平下降的情况下，周期表型仍然存在。这一发现表明RUVBL2可能通过不同于传统TTFL途径的方式影响生物钟周期。
更重要的是，研究人员测定了RUVBL2及其突变体的ATP水解酶活性，结果显示RUVBL2水解ATP的速度极慢，每24小时仅水解13个ATP分子。这一活性水平远低于典型AAA+ ATP酶，但与蓝藻KaiC的ATP水解速率（每天15个ATP分子）相当。这种低活性可能是维持24小时周期震荡的基础。进一步分析发现，RUVBL2的ATP酶活性与细胞周期长度呈显著负相关——较高的ATP酶活性对应更短的周期，较低的活性对应更长的周期，正如蓝藻的KaiC一样。结合结构分析和定点突变，研究人员发现，与KaiC类似，RUVBL1/RUVBL2晶体结构口袋里的水分子处于不利于对ATP进行亲核攻击的位置，导致RUVBL1/RUVBL2的ATP酶活性极低。这一发现进一步凸显了RUVBL2与蓝藻KaiC在生物钟调节机制上的相似性，为揭示真核生物与原核生物生物钟系统的进化关联提供了有力证据（图2）。
图2.在人源RUVBL1/RUVBL2复合物的ATP结合口袋中，水分子的位置与蓝藻KaiC相似，都处在一种非优化的进攻ATPγ-磷酸基团的状态，因而决定了它们是一类极慢速的ATP水解酶
RUVBL在真核生物中高度保守，其氨基酸序列相似性高达85%。通过梳理已有文献，研究人员发现RUVBL蛋白广泛分布于多种生物钟超复合物中，表明其可能与不同物种的核心生物钟成分存在潜在的相互作用。进一步结合免疫共沉淀和质谱分析，研究人员证实了RUVBL2的同源蛋白能够与哺乳动物、果蝇、拟南芥乃至粗糙脉胞菌的核心生物钟蛋白相互作用。此外，利用遗传学操作和药理学实验，研究人员发现RUVBL2在果蝇、拟南芥和粗糙脉胞菌中的同源蛋白也参与昼夜节律调控，并且其ATP酶活性与周期长度的关系与哺乳动物和蓝藻一致。这些证据进一步证实，RUVBL2作为保守的低活性ATP酶，在调节真核生物钟周期方面发挥了关键作用。
基于这些发现，研究团队提出了一个新的假设：在远古生命起源阶段，随着原始生物钟的出现，低活性的P-loop ATP酶成为生物钟系统的核心组件。蓝藻中，KaiC结合KaiA和KaiB组成了一个连接到TTFL的强大振荡器，而在真核生物中，含有P环的AAA+ ATP酶RUVBL2及其同源蛋白通过与TTFL生物钟蛋白相互作用，参与生物钟的调控。KaiC和RUVBL2极低的ATP酶活性共同决定了生物钟的24小时节律振荡，这一机制或许是生物钟系统进化的共同特征。
图3.艺术化呈现的生物钟起源模型
这个ATP酶驱动的沙漏隐喻了极慢的水解酶动力学决定了振荡的速度，促成了24小时的昼夜节律。背景中组成六聚体的RUVBL2是真菌、果蝇、植物和小鼠生物钟系统中的共同起源分子。
综上所述，该研究在之前的工作基础上，进一步证实了RUVBL2作为核心生物钟组分的作用，还揭示了其ATP酶活性如何以类似KaiC的机制调节真核生物的昼夜节律。这一发现丰富了真核生物钟的分子调节机制，并提出了低活性的ATP酶作为生物钟起源核心组分的进化假设，在进化生物学和生物钟研究领域具有重要意义。
清华大学生物医学交叉研究院研究员张二荃为论文的通讯作者。张二荃实验室的博士生廖媚妹、刘艳琴和徐占聪为论文的共同第一作者。研究得到中国国家重点研发计划、科技创新2030-重大项目、北京市政府、清华大学及美国国立卫生研究院的资助。
本文链接：http://knowith.com/news-3-2080.html生物医学交叉研究院张二荃实验室证明调控昼夜节律的核心组分RUVBL2是真核生物钟的共同起源分子
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